بررسی اثر فاکتور b بر پایداری آنزیم لوسیفراز تغییر یافته به روش جهش زائی اشباعی و هدفدار

لوسیفراز پروتئینی است که دارای یک دمین بزرگ در انتهای آمین و یک دمین کوچک در انتهای کربوکسیل است. آنالیزهای b-factor نشان دهنده این است که دمین انتهای کربوکسیل لوسیفراز، انعطاف پذیرتر از دمین انتهای آمین می باشد. مطالعه بر روی پروتئین های ترموفیل نشان داده است که پایداری دمائی پروتئین های ترموفیل در نتیجه استحکام ساختاری بیشتر آنها است. در ضمن ارتباط بین انعطاف پذیری، پایداری و عملکرد در اغلب پروتئین ها مبهم است. در این مطالعه جهت بررسی ارتباط بین پایداری و انعطاف پذیری در انعطاف پذیرترین بخش لوسیفراز در دو گونه lampyris turkestanikus و photinus pyralisاز دو روش جهش زائی اشباعی و جهش زائی هدفدار استفاده شده است. در لوسیفراز گونه l.turkestanikus، از روش جهش زائی اشباعی استفاده شد و کتابخانه ایجاد شده غربالگری شد. اما کلونی های دارای پایداری دمائی قابل توجه یافت نشد و دو کلونی با افزایش جزئی در پایداری دمائی انتخاب شده و تعیین توالی شدند. کلونی های انتخابی دارای جهش های p473l و p473r بودند. آنالیز های پایداری دمائی پروتئین های خالص نشان داد که جهش یافته های p474lو p473r کمی ناپایدار شده و هر دو جهش یافته نسبت به گونه وحشی انعطاف پذیرتر شده اند.در لوسیفراز گونه p.pyralis، جهش زائی هدفدار مورد استفاده قرار گرفت و دو جهش d474k و d476n در انعطاف پذیرترین بخش لوسیفراز طراحی و ایجاد شد. آنالیز های پایداری دمائی نشان داد که جهش d476n اثر چشمگیری در پایداری ایجاد نکرده است اما جهش یافته d474k ناپایدار شده است.از طرف دیگر آنالیزهای انعطاف پذیری با استفاده از فلورسانس خاموشی و پروتئولیز محدود نشان داد که جهش یافته d474k نسبت به پروتئن اصلی انعطاف پذیرتر شده در حالیکه d476n تفاوتی محسوس پیدا نکرده است، در ضمن مطالعات فلورسانس ans و فلورسانس ذاتی نشان داد که در جهش یافته d476n تغییرات ساختاری ایجاد شده اما این تغییرات ساختاری اثر محسوسی در پایداری و انعطاف پذیری ایجاد نکرده است. بررسی های بیوانفورماتیک نشان داد که تخریب یک پل نمکی بین d474 و k445، به همراه حذف یک پیوند هیدروژنی ممکن است علت های نا پایداری دمائی جهش یافته d474k باشند.